1 – O Ministério da Agricultura está implementando limites de tolerância para sanidade de sementes para várias espécies. Neste sentido, fez publicar Consulta Pública de Instrução Normativa estabelecendo os padrões fitossanitários e as respectivas metodologias de detecção, conforme segue:
Diário Oficial da União, Nº 3, terça-feira, 6 de janeiro de 2004.
SECRETARIA DE DEFESA AGROPECUÁRIA
PORTARIA Nº 3, DE 5 DE JANEIRO DE 2004
O SECRETÁRIO DE DEFESA AGROPECUÁRIA, DO MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E  ABASTECIMENTO, no uso da atribuição que lhe confere o art. 15, inciso II, do Decreto nº 4.629, de 21 de março de 2003,  tendo em vista o disposto no Decreto nº 24.114, de 12 de abril de 1934, e o que consta do Processo nº 21000.011367/2003-80,  resolve:
Art. 1º Submeter à consulta pública, por um prazo de 60 (sessenta) dias, a contar da data da publicação desta Portaria, o Projeto de Instrução Normativa e seus anexos, que trata da APLICAÇÃO,  EM TODO O TERRITÓRIO NACIONAL, DOS NÍVEIS DE TOLERÂNCIA E METODOLOGIA DE ANÁLISE FITOPATOLÓGICA PARA AS PRAGAS E RESPECTIVAS  CULTURAS.
Art. 2º As respostas à consulta pública, referida no art. 1º, devem ser fundamentadas tecnicamente, estarem assinadas pelo responsável e serem encaminhadas para o seguinte endereço: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento –  Departamento de Defesa e Inspeção Vegetal – Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo B, sala 303 – CEP 70.043-900 –  Brasília/DF. As respostas poderão, também, ser encaminhadas para o Fax nº (61) 224-3874 ou ao endereço eletrônico  tarcisio@agricultura.gov.br, desde que sejam, também, encaminhadas, via correio, para o endereço supracitado, para serem  anexadas ao processo.
Art. 3º Esta Portaria entra em vigor na data de sua publicação.
MAÇAO TADANO
ANEXO
PROJETO DE INSTRUÇÃO NORMATIVA SDA Nº , DE DE DE 2004
O SECRETÁRIO DE DEFESA AGROPECUÁRIA, DO MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E  ABASTECIMENTO, no uso da atribuição que lhe confere o art. 15, inciso II, do Decreto nº 4.629, de 21 de março de 2003,  tendo em vista o disposto no art. 3º, da Portaria nº 71, de 22 de fevereiro de 1999; o que determina o art. 1º da Portaria SDA nº  41, de 12 de setembro de 2001, e o que consta do Processo nº 21000.011367/2003-80, resolve:
Art. 1º Aprovar, para APLICAÇÃO EM TODO O TERRITÓRIO NACIONAL, DOS NÍVEIS DE TOLERÂNCIA ESTABELECIDOS PARA AS PRAGAS E RESPECTIVAS CULTURAS, conforme Anexo I.
Art. 2º Aprovar as METODOLOGIAS DE ANÁLISE FITOPATOLÓGICA, EM SEMENTES, ESTABELECIDAS PARA AS PRAGAS E RESPECTIVAS CULTURAS, conforme Anexo II.
Art. 3º A implantação dos padrões sanitários de sementes estabelecidos no art. 1º desta Instrução Normativa, bem como as ações dos órgãos fiscalizadores, obedecerão aos seguintes critérios e cronograma:
I – Primeiro ano: estruturação da cadeia produtiva de sementes, mediante o credenciamento e adequação de laboratórios, capacitação técnica de pessoal, validação das metodologias de análise e amostragem, e o estabelecimento e adequação dos  procedimentos de fiscalização por parte dos órgãos fiscalizadores, com monitoramento, ao acaso, das sementes e pragas  aprovadas no art. 1º.
II – Segundo ano: fiscalização dos níveis de tolerância estabelecidos em sementes básicas;
III – Terceiro ano: fiscalização dos níveis de tolerância estabelecidos em sementes básicas;
IV – Quarto ano: fiscalização dos níveis de tolerância estabelecidos em sementes básicas e sementes certificadas de primeira geração C1;
V – Quinto ano: fiscalização dos níveis de tolerância estabelecidos em sementes básicas e sementes certificadas de primeira geração C1;
VI – Sexto ano: fiscalização dos níveis de tolerância estabelecidos em sementes básicas, sementes certificadas de primeira geração C1 e sementes certificadas de segunda geração C2;
VII – A Partir do Sétimo ano: fiscalização dos níveis de tolerância estabelecidos para todas as classes de sementes.
Art. 4º Os níveis de tolerâncias aprovados e suas respectivas metodologias de análise, bem como a inclusão de novas culturas, poderão ser alterados, a qualquer tempo, mediante estudos técnico-científicos (Análise de Risco de Pragas – ARP) e parecer  favorável do Grupo Técnico Permanente em Sanidade de Sementes, os quais serão fixados por ato administrativo da Secretaria  de Defesa Agropecuária.
Art. 5º Esta Instrução Normativa entra em vigor na data da sua publicação.

ANEXO I

Pragas Não Quarentenárias Regulamentadas (PNQR) por Cultura e seus Respectivos Níveis de Tolerância Aprovados pelo  Grupo Técnico Permanente em Sanidade de Sementes
CULTURA
PNQR
NÍVEL DE TOLERÂNCIA (%)
Algodão
Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum
Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides
Xanthomonas axonopodis pv. Malvacearum
Sclerotinia sclerotiorum **
0 / lote
0 / lote
0 / campo
0 / lote
Arroz
(sequeiro)
Pyricularia griseae
Bipolaris oryzae
5 / lote
5 / lote
Trigo
Bipolaris sorokiniana
Stagonospora nodorum
Drechslera tritici-repentis
Xanthomonas campestris pv. Undulosa
5 / lote
1 / lote
5 / lote
1.000 UFC* / 3.000 sementes
Feijão
Colletotrichum lindemuthianum
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
Sclerotinia sclerotiorum**
Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli
Fusarium solani f. sp. Phaseoli
0 / lote
0 / lote
0 / lote
0 / lote
0 / lote
Soja
Sclerotinia sclerotiorum**
Hetrodera glycines***
0 / lote
0 / lote
Girassol
Sclerotinia sclerotiorum**
0 / lote
*UFC – Unidade Formadora de Colônia
**Escleródio/500g
***Torrão com cisto/500g
ANEXO II
MÉTODOS DE DETEÇÃO DE PRAGAS NÃO QUARENTENÁRIAS REGULAMENTADAS
Sementes de Algodão Gossypium hirsutum L.
NOME DO PATÓGENO
MÉTODO DE DETECÇÃO
Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides
Incubação em substrato de papel (“blottter test”)
Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum
Incubação em substrato de papel (“blottter test”)
Sclerotinia sclerotiorum
Exame visual da fração impura da amostra sub-metida
Xanthomonas axonopodis pv. Malvacearum
Meio semi-seletivo
Sementes de Arroz – Oryzae sativa
Método: Papel filtro em placas de Petri, caixas de Gerbox e/ou bandejas.
Procedimento: Colocar duas folhas de papel germitest e uma folha de papel filtro nos recipientes. Umedecer os papeis com uma solução de 0,02% de 2,6 dicloro-4-nitrobenzamine (Dicloran) para inibir Rhyzopus sp. e colocar  para germinar. Ao se iniciar a germinação, submeter ao congelamento (-20ºC) durante 12 horas. Após esse período, colocar em  câmara climatizada (20ºC + ou – 5ºC) por uma semana. Proceder à avaliação em estereomicroscópio binocular.
Características de auxílio à identificação:
Pyricularia grisea – Colônias escuras, características, conidióforos curtos e conídios escuros, quase negros (2 a 3). É bem  característica no papel filtro. Após identificação, não necessita mais estereomicroscópio, podendo a identificação ser realizada    em lupa de mesa, com magnitude de 10x.
Sementes de Cereais de Inverno – Trigo (Triticum vulgare Vill.)
Patógenos: Bipolaris sorokiniana
Stagonospora nodurum
Drechslera tritici-repentis
Método usado: Papel filtro em placas de Petri, caixas de Gerbox e/ou bandejas.
Procedimento: Colocar duas folhas de papel germitest e uma folha de papel filtro nos recipientes. Umedecer os papeis com uma solução de 0,02% de 2,6 dicloro-4-nitrobenzamine (Dicloran) para inibir Rhyzopus sp.. Retirar o excesso da solução,  tampar e/ou vedar e colocar para germinar. Ao iniciar a germinação, submeter ao congelamento (-20ºC) durante 12 horas. Após esse período, colocar em câmara climatizada (20ºC + ou – 5ºC) por uma semana. Proceder à avaliação em  estereomicroscópio binocular.
Características de auxílio à identificação:
Bipolaris sorokiniana – Fácil identificação. Colônias escuras, conidióforos curtos e conídios escuros, quase negros (2 a 3). É  bem característica no papel filtro. Após identificação, não necessita mais estereomicroscópio, podendo a identificação ser  realizada em lupa de mesa com iluminação e magnitude de 10x.
Stagonospora nodorum – É interessante a substituição do papel de filtro comum por uma de papel filtro qualitativo (faixa azul  ou simular), que é isento de cinzas para melhorar a fluorescência do fungo sob luz negra. É necessário uma laboratorista  experiente para não confundir com algumas bactérias e, mesmo, fungos que podem conduzir pigmentos fluorescentes. Uma  vez identificada, é de fácil visualização, pois S. nodorum provoca um anel de coloração néon esverdeado, bem característico, ao redor da semente infectada.
Drechslera tritici-repentis – Fácil identificação. O micélio possui coloração esbranquiçada, em forma de tufos, com  conidióforos longos e, normalmente, dois conídios. Vale ressaltar que, nem sempre, o fungo forma conídios.
Patógeno: Xanthomonas campestris pv. Undulosa (mancha estriada)
Método usado: Meio semi-seletivo
Procedimento: Em um Erlenmeyer de 500 ml, adicionar 125 g de sementes de trigo (+/- 3.000 sementes) + 125 ml de água  gelada (2ºC a 5ºC), salina (0,85% NaCl) e estéril. Agitar por três minutos, com duas gotas de Tween 20. Preparar 3 diluições:  (10 -1 , 10 -2 e 10 -3 ). De cada uma delas, espalhar com auxílio de uma alça 1,0 ml para cada placa de Petri (14 cm) ou em 3  placas (9 cm) contendo o meio de cultivo composto de: 23 g de nutriente Agar, 5 g de glicose, 200 mg de ciclohexamida, 8 g  de gentamicina e 10 mg de cephalexina. Incubar as placas, a 30ºC, por 5 dias. Avaliar em estereo-microscópio e/ou contador de  colônias apropriado. As colônias da bactéria ficam um formato de ovo cru, onde a parte mucosa é a clara e a pigmentada a  gema. Para facilitar a identificação e a leitura, sugere-se a adição de X-gal (10 mg/litro) que confere à colônia uma coloração  esverdeada.
Sementes de Feijão (Phaseolus vulgaris)
Métodos usados: a) Papel filtro em placas de Petri/Gerbox e/ou bandejas
b) Papel de filtro modificado.
c) Método semi-seletivo.
Patógenos a serem avaliados: Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum e F. solani, Sclerotinia sclerotiorum  eXanthomonas campestris pv. phaseoli.
Papel filtro em placas de Petri/Gerbox e/ou bandejas
Patógenos: Colletotrichum lindemuthianum.
Fusarium oxysporum.
Fusarium solani.
Colocar duas folhas de papel germitest e uma folha de papel filtro nos recipientes. Esse método consiste em se distribuir 10  sementes sobre três folhas de papel de filtro embebidas em água destilada em placas de Petri (9 cm ou 14 cm), 25 em gerbox e  100 em bandejas. Após o plaqueamento, o material é depositado em câmara de incubação/climatizada, com temperatura de  20ºC +/- 2ºC e luz fluorescente alternada (12 h x 12 h) por um período 7 dias. Após esse período, avalia-se, com auxílio de estereomicroscópio e, se necessário, microscópio composto, identificando-se os patógenos presentes nas sementes.
b) Papel de filtro modificado
Patógeno: (Sclerotinia scleroriorum)
Para a instalação desse teste, procede-se da mesma maneira descrita anteriormente. A modificação consiste em se incubar as  placas/gerbox e/ou bandejas sob temperatura de 15ºC em escuro continuo, durante 14 dias (Koch & Menten, 2000). A  avaliação é feita mediante analise a olho nu, do crescimento micelial e formação de esclerócio de Sclerotinia sclerotiorum.
Método semi-seletivo
Patógeno: Xanthomonas campestris pv. phaseoli.
Separar a amostra de trabalho em 5 subamostras de 10, 5 subamostras de 100 e 1 subamostrade 500 sementes, segundo o  método do Numero Mais Provável (NMP). Tais amostras são colocadas em Erlenmeyers e imersas em quantidades variáveis  de água destilada, como mostra o quadro a seguir:
Número de Sementes
Volume do Líquido para Imersão (ml)
Tamanho do Erlenmeyer
500
180
500
100
40
250
10
15
125
Após a imersão das sementes, os fracos são deixados em geladeira (5ºC a 10ºC), por 24 horas, e retirados duas horas antes de  se proceder à repicagem para o meio semi-seletivo. A suspensão é repicada para as placas com o meio, utilizando-se duas  placas para cada subamostra e duas repicagens por placa. A seguir, as placas são incubadas sob temperatura de 28ºC a 30ºC por  72 horas. Após esse período, é feito o reconhecimento das colônias pelo formato, coloração e halo hialino e volta da colônia, depois de se adicionar lugol com azul de metileno. Como controle, utiliza-se água destilada e esterilizada (controle branco) e  suspensão de colônia de X. axonopodis pv. phaseoli (controle positivo).
Observação: Uma placa com colônia característica é suficiente para indicar resultado positivo. Os resultados expressos como   número de amostras positivas ou negativas são interpretadas pelo método NMP (Cochran, 1950), seguindo a tabela descrita por  Swaroop (1951).
Meio semi-seletivo: (Maringoni, 1996)
COMPONENTES
QUANTIA / 0,5 l
Peptona
Extrato de Carne
Amido Solúvel
Sacarose
Agar
Água Destilada
Benomyl (solução 1)
Chorothalonil (solução 2)
Cephalexina (solução 3)
Ácido Nalidíxido (solução 4)
Nitrofurantoína (solução 5)
2,5 g
1,5 g
1,0 g
5,0 g
6,5 g
486,0 ml
5,0 ml
5,0 ml
2,5 ml
0,5 ml
1,0 ml
Autoclavar a 120ºC /1 atm./30 minutos. Após a autoclavagem, com o meio a 50ºC, adicionar as soluções.
Solução de Benlate 500 PM (Benomyl): 0,4 g do p. c./100 ml de água destilada e esterilizada.
Solução de Daconil (Chlorothalonil): 0,27 g do p. c./100 ml de água destilada e esterilizada.
Solução de Keflex (Cephalexina): 1,2 g do p. c./100 ml de água destilada e esterilizada.
Solução de Wintomylon (Ácido nalidíxico): 2 ml do p. c./98 ml de água destilada e esterilizada.
Solução de Macrodantina (Nitrofurantoína): 1,0 g do p. c./100 ml de água destilada e esterilizada.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária.
Regras para Análise de Sementes. Brasília, 1992. 365 p.
KOCH, E. F. & MENTEN, J. O. M. Método Alternativo para a Detecção de Sclerotinia sclerotiorum em Sementes de Feijoeiro. Summa Phytopathologica, v. 26, p. 276-279.2000.
MARINGONI, A. C. FREGONESE, L. H., TOFOLI J. G. & KOROSAWA, C. Reação Foliar e da Vagem do Feijoeiro à Xanthomonas campestris pv. Phaseoli e Transmissão da Bactéria pelas Sementes. Fitopatologia Brasileira 18:412-415. 1993.
SEMENTES DE SOJA (Glycine Max)
De acordo com a descrição contida nas Análises de Risco de Pragas:
(1) Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) DeBary podridão de sclerotinia: método de papel de filtro (7 dias a 20ºC mais ou menos  2ºC). Todavia, se a temperatura for reduzida para 18ºC e o período de incubação elevado para duas semanas, aumenta a  possibilidade de se detectar o fungo nas sementes (MENTEN, Comunicação pessoal).
(2) Heterodera glycines Ichinoe – nematóide de cisto da soja: a metodologia de detecção é a preconizada pela EMBRAPA Soja  e EMBRAPA Recursos Genéticos. Todavia, existe sempre o risco de “erro de amostragem”, uma vez que os cistos são detectados nos torrões de solo misturados às sementes. Dependendo do tamanho do lote e das condições de transporte e  manuseio, estes podem sedimentar-se e escaparem da amostragem.
6. SEMENTES DE GIRASSOL (Helianthus annus)
De acordo com a descrição contida na Análise de Risco de Praga:
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) DeBary – murcha de sclerotinia: método do papel de filtro (7 dias a 20ºC mais ou menos 2ºC)