Transcrevemos abaixo a descrição geral do projeto para desenvolvimento de ferramentas e procedimentos para diagnóstico da ocorrência de nematóide em sementes de gramíneas forrageiras.
Acreditamos ser este um modelo e um exemplo da possibilidade de sinergia entre o setor privado de produção e instituições de pesquisa, na solução de problemas, incremento tecnológico e fomento dos negócios e das exportações brasileiras.
As empresas patrocinadoras do referido projeto são:
    · Comercializadora  e Exportadora de Sementes Germisul Ltda.;
    · Comércio e Industria Matsuda Importação e Exportação Ltda.;
    · Facholi Prod. Comércio e Ind. Imp. e Exp. Ltda.;
    · Germipasto Ind., Com., Imp., e Exp. de Sementes Ltda.;
    · Marangarú Sementes Ltda.;
    · Ouro Fino Agrosciences Ltda.;
    · Pastobras Sementes Ltda.;
    · Sementes Gasparim – Prod., Com., Importação e Exportação Ltda.;
    · Sementes J. C. Maschietto Ltda.;
    · Sementes Oeste Paulista Importadora e Exportadora Ltda – SOESP;
    · Sementes Rancharia – Gerson Pequeno de Brito; e
    · Wolf Seeds do Brasil S/A
Diagnóstico molecular do nematoide Aphelenchoides besseyi em sementes de forrageiras
Cláudio Marcelo G. Oliveira1
Pesquisador Científico V
Erika Aparecida Consoli
Estagiária, acadêmica de Engenharia Agronômica (ESALQ, USP)
1Laboratório de Nematologia
Centro Experimental Central do Instituto Biológico
Caixa Postal 70, CEP 13001 970
Campinas, SP
Fone (19) 3251 03 27
Os nematoides não são animais fáceis de serem identificados, seja pelo tamanho diminuto ou pela dificuldade de observação de características essenciais para o diagnóstico sob microscopia de luz convencional. Essas limitações são válidas para a maioria dos nematoides parasitos de plantas, incluídas as espécies pertencentes ao gênero Aphelenchoides.
Nematoides do gênero Aphelenchoides apresentam ampla distribuição mundial. Suas espécies alimentam-se principalmente de fungos, ou seja, são micófagas, embora umas poucas também possam parasitar plantas cultivadas, quase sempre causando danos na parte aérea. No Brasil, as principais espécies são Aphelenchoides fragariae, A. besseyi e A. ritzemabosi.

Diferente da grande maioria dos nematoides parasitos de plantas, que ataca principalmente raízes e/ou outros órgãos subterrâneos, Aphelenchoides besseyi parasita órgãos aéreos. Trata-se de espécie cosmopolita, com muitas plantas hospedeiras, destacando-se entre elas: arroz, morango, alho e várias plantas ornamentais. Também pode ser encontrado em sementes de gramíneas forrageiras como Panicum maximum e Brachiaria decumbens. Nestes casos, tais sementes podem atuar como agentes de disseminação do nematóide, levando-o de um país a outro; por isso, existem restrições para a comercialização delas, sobretudo no mercado externo, impostas por rígidas legislações fitossanitárias. No entanto, cabe ressaltar que, até o presente, esses nematoides nunca foram associados a perdas nessas forrageiras.

Para algumas espécies, como A. besseyi, um único exemplar do nematoide presente na amostra leva à rejeição de todo o lote de sementes da forrageira. Esse único exemplar pode estar presente na amostra junto a outras espécies de nematóides consideradas ‘não alvo’, mas semelhantes morfologicamente. Nesse sentido, a técnica utilizada para identificação da espécie presente necessita ser precisa e bastante confiável, de modo a auxiliar o difícil serviço de análise fitossanitária.

Tradicionalmente, as características morfológicas têm sido utilizadas para discriminação e identificação das espécies. Entretanto, tais diferenças no geral são relativamente pequenas, sendo exigido considerável conhecimento em taxonomia para que se proceda à identificação de forma segura. Ademais, devido à diminuição contínua que ora se observa, mundialmente, no número de profissionais especializados na identificação clássica de vários grupos de organismos, incluindo nematoides, há uma crescente procura pelo desenvolvimento de técnicas moleculares visando à identificação de pragas e patógenos.

Várias metodologias baseadas em técnicas moleculares vêm sendo desenvolvidas para aplicação na nematologia. Tais técnicas proporcionam diagnósticos rápidos e precisos, não requerendo taxonomistas altamente treinados. Isso é particularmente importante para o gênero Aphelenchoides, em que espécies como A. besseyi e A. fragariae, por exemplo, continuam a ser, ainda hoje, distintas apenas por pequenas diferenças morfológicas e morfométricas.

Até o momento, com poucas exceções, metodologias baseadas em técnicas moleculares foram desenvolvidas principalmente para espécies dos gêneros Meloidogyne, Heterodera, Pratylenchus e Globodera. No caso de Aphelenchoides, sabe-se que nematologistas norte-americanos já desenvolveram um primer específico para A. fragariae, o que, sem dúvida, representou significativo avanço; contudo, há ainda clara necessidade de desenvolvimento de metodologia semelhante para outras espécies igualmente importantes dentro do gênero, a exemplo de A. besseyi.

Recentemente, visando atender a uma demanda do setor produtivo, o laboratório de nematologia do Instituto Biológico, com apoio financeiro de representantes da Associação Paulista dos Produtores de Sementes e Mudas (APPS), iniciou projeto de pesquisa que tem como meta a identificação molecular de Aphelenchoides besseyi eventualmente presente em amostras de sementes de forrageiras.

Assim, objetiva-se, ao final deste estudo, disponibilizar o uso de primers específicos que, com credibilidade e rapidez, possam discriminar o nematoide Aphelenchoides besseyi extraído das sementes.

Cada primer específico será localizado na região ITS-1 do DNA ribossomal (rDNA) e utilizado em combinação com um primer universal localizado no gene 18S rDNA. A credibilidade dos primers será confirmada pelo teste de diferentes populações da espécie alvo (
A. besseyi) extraídas de sementes de Panicum maximum e Brachiaria spp. provenientes de várias regiões brasileiras produtoras de forrageiras, enquanto que a especificidade será demonstrada pela ausência de reação cruzada com outras espécies de Aphelenchoides. O projeto teve início no mês de setembro de 2009, com término previsto para o primeiro semestre de 2010.

Espera-se que o avanço científico decorrente da obtenção e utilização dos primers específicos pelas clínicas nematológicas na diagnose de Aphelenchoides besseyi venha a ser de grande préstimo aos serviços de fitossanidade tanto do Brasil quanto dos países importadores de sementes de forrageiras. Da mesma forma, aos produtores brasileiros de forrageiras, prevenindo a disseminação dessa espécie de nematoide de importância quarentenária.